Identität per Massenspektrometrie: warum ein CoA zwei Prüfungen braucht

Reinheit und Identität sind zwei verschiedene Fragen. Die HPLC beantwortet, welcher Anteil des UV-Signals auf den Hauptpeak entfällt. Die Massenspektrometrie (MS) beantwortet, ob die Substanz die Masse hat, die ihre Sequenz erwarten lässt. Ein Analysezertifikat, das nur eine der beiden Fragen beantwortet, lässt die andere offen.

Zwei Fragen, zwei Methoden

Beide Prüfungen gehören zur selben Chargennummer. Wie Sie die übrigen Felder eines Zertifikats lesen, steht in Ein Analysezertifikat lesen.

Warum die HPLC die Identität nicht klärt

Ein Chromatogramm zeigt Peaks und ihre Flächen. Welche Substanz in einem Peak liegt, zeigt es nicht. Eine hohe Reinheit bedeutet nur, dass ein Peak den Großteil des Signals ausmacht.

Eine Arbeitsgruppe der Universität Gent, die 98 bestellte Forschungspeptide untersucht hat (Verbeke und andere, 2015), hat bei 15 davon geprüft, was in den Peaks liegt. In 14 Fällen war der Hauptpeak das bestellte Peptid. Bei einem Peptid war er es nicht. Dort lag die gemessene Masse 2,1 Dalton unter der erwarteten. Die Autoren vermuten eine Disulfidbrücke zwischen den beiden Cysteinen der Sequenz, also ein ringförmiges Molekül statt des bestellten linearen. Sie weisen ausdrücklich darauf hin, dass der Hauptpeak eines Chromatogramms eine Verunreinigung sein kann statt des bestellten Peptids.

Was die Massenspektrometrie misst

Die MS bestimmt die Molekülmasse einer Substanz. Für ein Peptid lässt sich die erwartete Masse aus der Sequenz berechnen. Das Zertifikat vergleicht dann zwei Zahlen: die erwartete und die gemessene Masse. Stimmen beide innerhalb der Messgenauigkeit überein, spricht das für die erwartete Substanz.

Weicht die Masse ab, gibt die Differenz einen Hinweis darauf, was passiert ist. Bei der Synthese entstehen typische Nebenprodukte, darunter Sequenzen mit fehlenden oder zusätzlichen Aminosäuren und oxidierte Formen. Zwei Beispiele aus der Gent-Studie:

• Minus 2,1 Dalton: passend zu einer Disulfidbrücke, wie oben beschrieben.
• Plus 14,04 Dalton: passend zu einer zusätzlichen Methylgruppe.

Die meisten Verunreinigungen, die die Gruppe identifiziert hat, waren Sequenzen, denen eine oder mehrere Aminosäuren fehlten.

Bruchstücke für die Sequenz

Eine einfache Massenmessung zeigt die Masse des ganzen Moleküls. Bei der Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) zerlegt das Gerät das Molekül zusätzlich in Bruchstücke. Deren Massen erlauben Rückschlüsse auf die Reihenfolge der Aminosäuren. Die Gruppe in Gent hat auf diesem Weg die Sequenzen der Verunreinigungen bestätigt.

Die Grenze der Massenmessung

Gleiche Masse heißt nicht gleiche Struktur. Epimere, also Varianten, die sich nur in der räumlichen Anordnung an einer Stelle unterscheiden, haben dieselbe Masse wie das Ausgangspeptid. Die Massenspektrometrie kann sie nicht unterscheiden; dafür braucht es eine chromatographische Trennung (Mazzoccanti und andere, 2020).

Umgekehrt sagt ein Massenspektrum mit der erwarteten Masse nicht, wie groß der Anteil dieser Substanz an der Probe ist. Das misst die HPLC, mit den Grenzen, die der Artikel HPLC-Reinheit beschreibt. Ob es die richtige Substanz ist und welchen Anteil sie hat, beantworten erst beide Messungen zusammen.

LC-MS: Trennung und Masse in einem Lauf

Bei der LC-MS ist die Trennsäule direkt mit dem Massenspektrometer gekoppelt. So bekommt jeder Peak des Chromatogramms eine Masse. Die Gruppe in Gent hat mit dieser Kopplung ihre Verunreinigungen zugeordnet. Ein Zertifikat, das auf einer LC-MS-Messung beruht, kann deshalb zeigen, dass die erwartete Masse im Hauptpeak liegt und nicht in einem Nebenpeak.

Was Sie auf dem Zertifikat suchen sollten

• eine Identitätsprüfung mit Methode, erwarteter und gemessener Masse;
• eine Reinheitsprüfung mit Methode, Wellenlänge, Spezifikation und Zahlenwert;
• dieselbe Chargennummer für beide Prüfungen;
• im besten Fall das Massenspektrum und das Chromatogramm der Charge als Anlage.

Bei Novo Labo erhalten Sie das Analysezertifikat einer Charge auf Anfrage an hello@novolabo.com. Alle Produkte werden ausschließlich für Labor- und Forschungszwecke verkauft.