HPLC-Reinheit: was die Prozentzahl misst und was nicht

Eine HPLC-Reinheit sagt, welcher Anteil des UV-Signals bei einer bestimmten Wellenlänge auf den Hauptpeak entfällt. Sie sagt nicht, wie viel Peptid in einem Milligramm Pulver steckt: Wasser, Gegenionen und Salze tauchen in dieser Zahl nicht auf. Wer beides auseinanderhält, liest ein Analysezertifikat richtig.

So entsteht die Zahl

Bei der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) läuft die gelöste Probe durch eine Trennsäule. Ein UV-Detektor misst, was die Säule verlässt; für Peptide nennt der Hersteller Bachem eine Detektion bei 210 bis 220 nm. Jede getrennte Substanz erscheint als Peak im Chromatogramm.

Die Reinheit ist dann die Fläche des Hauptpeaks im Verhältnis zur Gesamtfläche aller Peaks:

Reinheit (Flächenprozent) = Fläche des Hauptpeaks / Summe aller Peakflächen × 100

Fachleute nennen das Flächennormierung. Die Zahl ist also ein relativer Anteil im Chromatogramm, keine Masse und kein Gehalt.

Was die Zahl nicht enthält

Ein lyophilisiertes Peptid besteht nicht nur aus Peptid. Bachem liefert Peptide nach eigener Angabe meist als Trifluoracetat-Salze, also mit TFA als Gegenion; durch Flüssigphasensynthese hergestellte Peptide meist als Acetat oder inneres Salz. Dazu kommt Restwasser. Diese Bestandteile misst Bachem mit eigenen Methoden, nicht mit der Methode für die Reinheit.

Bachem schreibt dazu: Forschungspeptide sind nach HPLC typischerweise zu mehr als 95 % rein, der Peptidgehalt des Feststoffs kann trotzdem zwischen 70 und 90 % liegen, weil Gegenionen und Restfeuchte mitwiegen. Bei Peptiden mit vielen basischen Aminosäuren, besonders Arginin, ist ein niedriger Peptidgehalt zu erwarten.

Ein Analysezertifikat kann deshalb mehrere Werte nennen, die verschiedene Fragen beantworten:

Der Peptidgehalt zählt peptidische Verunreinigungen mit, die Reinheit nicht. Die beiden Zahlen messen also Verschiedenes.

Warum dieselbe Probe zwei Reinheiten haben kann

Die Flächennormierung zählt alles, was im Hauptpeak liegt. Trennt die Säule eine Verunreinigung nicht vom Hauptpeak, zählt sie als Hauptsubstanz mit. Die Reinheit hängt deshalb von der Methode ab: Säule, Laufmittel, Gradient, Wellenlänge.

Ein Beispiel aus der Literatur: Eine Arbeitsgruppe der Universität Gent maß ein Peptid, für das der Lieferant mindestens 95,0 % angegeben hatte, mit einer anderen Säule und bei 210 statt 220 nm nach. Sie fand 80,6 %. Nach ihrer Bewertung war die Methode des Lieferanten nicht trennscharf genug (Verbeke und andere, 2015).

Eine Reinheitsangabe ohne Methode lässt sich daher kaum beurteilen. Mehr dazu, welche Angaben ein Zertifikat tragen sollte, steht in Ein Analysezertifikat lesen.

Eine Peak-Tabelle lesen

Zu einem Chromatogramm gehört meist eine Tabelle mit diesen Spalten:

• Peak-Nummer: in der Reihenfolge, in der die Substanzen die Säule verlassen.
• Retentionszeit: wann der Peak erscheint, in Minuten.
• Fläche: die integrierte Fläche unter dem Peak.
• Flächenprozent: der Anteil dieses Peaks an der Gesamtfläche.

Prüfen Sie beim Lesen vier Punkte. Erstens: Sind Wellenlänge und Methode angegeben? Zweitens: Ergeben die Flächenprozente zusammen 100? Drittens: Stimmt der Flächenanteil des Hauptpeaks mit der Reinheit im Zertifikat überein? Viertens: Ab welcher Größe führt die Tabelle Peaks überhaupt auf? Die Gruppe in Gent setzte diese Meldegrenze bei 0,1 % der Fläche des Hauptpeaks an. Kleinere Peaks erscheinen dann nicht in der Tabelle.

Die Peak-Tabelle sagt nichts darüber, welche Substanz im Hauptpeak liegt. Das klärt erst eine Identitätsprüfung.

Was das für Ihre Arbeit bedeutet

Lesen Sie die HPLC-Reinheit als das, was sie ist: der Anteil des Hauptpeaks unter genau diesen Messbedingungen. Für den Gehalt an Peptid im Pulver brauchen Sie den Peptidgehalt, für die Frage nach der richtigen Substanz die Massenspektrometrie. Bei Novo Labo erhalten Sie das Analysezertifikat einer Charge auf Anfrage an hello@novolabo.com.